药学论文：参七抗癌散的药效物质基础研究

第一章文献综述

第一节、参七抗癌散研究概况

参七抗癌散来自于张德忠教授家传经验方，临床运用数十年，疗效甚佳，特别是张德忠教授 40 年运用本方加减治疗肿瘤患者 2 万余例，对于肿瘤患者改善症状，减轻痛苦，提高生存质量，肿瘤的控制缩小、消失，有较好的疗效。参七抗癌散由西洋参、三七、白花蛇舌草、半枝莲、夏枯草、当归、柴胡、白芍、枳壳、甘草十味药组成。在中医方面有如下研究：合而成，攻而不峻，补而不瘀，软坚不破血、调达气血使冲和，扶正不滞瘀，祛邪不伤正，对肿瘤患者属气虚、气滞、湿聚积聚、热毒等均可使用。既能攻邪以控制瘤体，又能补虚而起到明显改善患者临床症状之功能。

本课题在张德忠教授传统经验方临床治疗肿瘤疗效甚佳的基础上，对参七抗癌散的抗肿瘤活性及其作用机理进行深层次研究，其研究思路和方法注重中医药理论的指导，对实验结果的分析和相应对策也是从中医学中气的本源出发，立足与病药相应的原则。

一、参七抗癌散方解

以甘草解毒，调和诸药为使药。主要功能为益气活血，软坚散结，解毒止痛。主治气血痰湿郁结所致气虚、血瘀、痰聚、湿滞所致疼痛，或神倦、乏力、进行性消瘦，或内虚烦闷，脉细涩，或脉细弦，舌暗红或有瘀斑，苔黄。常用于肿瘤所致的气虚、血瘀证。临床可结合西医检查肿瘤的性质、肿块的大小，随证加减，疗效更佳。

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第二节、中药复方抗肿瘤研究进展

据统计，癌症的死亡率呈逐年上升趋势，医学界一直致力于抗癌药物的研究，现如今中药抗癌的研究水平也不断在提高，中医治疗在抗肿瘤中发挥了重要的作用。中药从多靶点、多方位来治疗癌症，它具有毒副作用小、药源广泛、价格低廉等特点，中药抗癌的崛起使中药一跃成为国内外研究的热点，备受医学界关注，现以探讨中药防治肿瘤的研究进展，为研究开发防治肿瘤的中药新药奠定理论基础。

一、中药复方物质基础的研究思路

（一）、中药有效部位的重要性

中药有效部位新药是至少 2 个以上的化合物产生药理活性，其研制和开发应既能反映中药特色又能提高作用强度和临床疗效。药学研究的最终目的是使药物安全有效，中药一直被认为是对人体安全有效的，但在国内医药市场上缺乏单用作用较强和疗效快的品种，影响中药走向国际主流医药市场的主要原因是其疗效弱，作用时间长。所以，我们应从物质基础和作用机制的研究入手（见图一），提高中药的疗效与质量，推动它进入国际医药市场。

（二）、中药有效部位和成分的研究

国内外对中药抗肿瘤机理研究在逐渐深入，从系统分析到内在联系，对其抗肿瘤作用由多方面研究到准确定位。从研究天然中药抗肿瘤成分及其有效成分的提取鉴定，并加强对各成分作用机制的研究，探索其有效成分与其他化疗药物联用的协同效应,为相应恶性肿瘤的临床治疗提供新的手段。被认为是有效部位新药，一是有效部位均由有效成分组成，且能产生相应的药效；二是有效部位中大部分是有效成分,三是该有效部位大部分不是有效成分, 只有小部分是有效成分。我们在研制过程经常发现当一类成分经分离纯化后药效降低，说明该药的有效成分同时存在于有效部位和非有效部位中，且有较强的活性，但活性成分是微量的，可能与有效部位的活性成分产生协同作用。这些微量成分很可能被忽视而造成有效部位纯度越高而作用越弱。所以，微量成分也是有效成分，几种微量成分之间发生协同作用而成为有效成分。非有效部位的有效成分或该部分与有效部位中的化学成分共同产生药理作用。如龙葵[1]和青天葵氯仿和醋酸乙酯提取物为抗肿瘤作用的有效部位，有明显的抑瘤作用；通光藤[2]的水溶性和脂溶性部位均有明显的抗肿瘤作用。又如黄酮类化合物为天然活性产物，具有天然、低毒和高效的特点，能抑制和治疗肿瘤；多糖类中的黄芪多糖是重要的有效活性成分，能调节免疫和诱导凋亡；生物碱类较强的生物活性能诱导肿瘤细胞凋亡。瑞香狼毒总生物碱[3]诱导 Bel-7402 细胞和 SGC-7901 细胞凋亡；三萜类中的熊果酸的生物活性有抗肿瘤血管生成、诱导凋亡和增强免疫等[4]，芹菜素 [5]有明显的抑瘤作用。马兜铃内酰胺大豆中一种名为 Lunasin[6]的抗癌肽对癌细胞具有较强的抑制作用。

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第二章 参七抗癌散有效物质部位的筛选研究

近二十年来，张德忠教授运用参七抗癌散治疗肿瘤患者数千例，对于肿瘤患者改善症状、减轻痛苦、提高生存质量、控制肿瘤发展显示了较好效果[118-119]，特别在治疗肺癌方面体现了中医药的治疗优势[120]。为了探讨该医院制剂的药效物质基础，本论文首先对参七抗癌散的抗肿瘤活性物质部位进行了体外筛选，为后续研究工作奠定基础。

第一节、参七抗癌散不同化学物质部位的提取分离

参七抗癌散处方为：西洋参 0.5 g、三七 1.0 g、白花蛇舌草 2.5g、半枝莲 2.5g、夏枯草 2.5g、当归 1.0g、柴胡 1.0g、白芍 2.0g、枳壳 1.0g、甘草 1.0g。将该医院制剂组方视为整体，采用超临界 CO2萃取技术和系统溶剂法，将其提取分离成不同的化学物质部位，即为超临界 CO2 萃取物 A、总多糖 B、石油醚 C、三氯甲烷萃取物 D、乙酸乙酯萃取物 E、正丁醇萃取物 F 和萃余水相 G。

1. 参七抗癌散超临界CO2萃取物的制备

将柴胡、当归、白芍、枳壳四味药材，分别粉碎，并过24目筛，按3倍处方量称取四味药材，投入萃取釜Ⅱ中；萃取路线：CO2钢瓶→冷冻系统→萃取釜Ⅱ→解析釜Ⅰ→解析釜Ⅱ→贮罐→循环；当萃取釜、解析釜Ⅰ、解析釜Ⅱ的控制温度分别为35℃、40℃、40℃时，再通过高压泵通入CO2气体加压，当压力分别达到15MPa、5.2MPa、5.0MPa时，开始恒温恒压循环萃取，CO2流量20L/h，萃取2h停泵，收集萃取物，密封低温保存。

2. 参七抗癌散三氯甲烷萃取物的制备

将处方中所有药材按3倍处方量的比例称取，混合，用药材量8倍的70%乙醇回流提取两次，提取时间分别为2h和1.5h，过滤合并提取液，减压浓缩得乙醇提取物，药渣于自然条件下挥至无醇味。乙醇提取液加入适量水分散至相对密度为1.05，即为浓缩液1，再用等体积的石油醚脱脂两次，用1mol/mLNaOH溶液调pH至12，然后用等体积三氯甲烷萃取5次，最后将萃取液减压浓缩、干燥称重，得到三氯甲烷萃取物。

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第二节、参七抗癌散有效物质部位的筛选

一、实验材料

1、细胞

人非小细胞肺腺癌 A549（武汉大学保藏中心），用含 10%的胎牛血清的 RPMI-1640 培养液培养。

2、药物

样品：石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、总多糖和萃余水相等。

阳性药：CDDP（标准品，中国药品生物制品鉴定所 ID：E3KQ-BMZF）。

二、实验方法

1、细胞的复苏

从液氮瓶中取出细胞冻存管，转移到 37℃的水浴锅中。观察细胞完全解冻后，在超净工作台中将细胞悬浮液吸入到离心管中，1000 r/min，10min，离心，然后弃上清，加细胞培养液混匀，最后将细胞转移到培养皿中，加入培养液，放入 5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养。

2、细胞的冻存

当培养皿里的细胞长至 80％-90％时，用移液枪吸出培养皿内的培养液，用 PBS 润洗 2 次，加入 1mL 的胰蛋白酶消化，然后将胰蛋白酶吸去，加入 2ml 的培养基，用吸管反复小心地吹打瓶壁上的细胞，使细胞分散均匀，离心，1000r/min，10 min，弃上清，加入培养液，置于 4℃冰箱中预冷 2h 后加 DMSO，再将其移至-20℃，4h 后将冻存管放入液氮瓶中保藏。

3、体外细胞培养

人肺腺癌细胞A549以适量浓度接种于培养瓶中，加入含10%的胎牛血清、100U/mL 的青霉素、100U/mL 的链霉素的 RPMI-1640 培养液，置于 37℃恒温、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞呈贴壁生长。每2-3天传代一次，传代时用0.02%EDTA消化2-3min，弃去消化液，加入新培养液吹打均匀，按所需细胞量移入新培养瓶中，添加完全培养液至适量。

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第三章 参七抗癌散有效物质部位的化学成分研究............................. 29

第一节 参七抗癌散氯仿萃取物的 HPLC-MS 分析........................ 30

第二节 有效物质部位化学成分的分离与鉴定............................... 35

一、分离纯化............................................................ 36

第四章 参七抗癌散有效物质抗人肺腺癌 A549 细胞的作用机理研究... 49

第一节 参七抗癌散有效物质部位诱导 A549 细胞凋亡研究........ 49

第二节 SS-6 抗人肺腺癌 A549 细胞作用机制研究..................... 64

一、SS-6 抗人肺腺癌 A549 细胞凋亡机制研究...................... 69

第三章 参七抗癌散有效物质部位的化学成分研究

体外细胞筛选实验表明，参七抗癌散中的氯仿萃取物为其抗肿瘤的有效物质部位。本节将采用 HPLC-MS 技术对参七抗癌散抗肿瘤有效物质部位—氯仿萃取物的化学成分进行分析，以期阐释参七抗癌散抗肿瘤的物质基础。

第一节、参七抗癌散氯仿萃取物的 HPLC-MS 分析

一、实验材料

1、仪器

（1）高效液相色谱仪：Agilent 1200 series（德国）；

（2） micrOTOF-Q 四极杆-飞行时间质谱仪(美国布鲁克道尔顿公司)；

（3）色谱柱：Aglient ZORBAX SB-C18 柱（250mm×4.6mm，5μm）；

（4）分析天平（BP-211D 型，德国 Sartorius）等。

2、试药

氯仿萃取物，乙腈、甲醇、甲酸等均为色谱纯，其它试剂为分析纯。

3、供试品溶液的制备

精密称取氯仿萃取物 0.10g，置于 10mL 量瓶中，甲醇溶解超声，定容摇匀。精密吸取 2.00mL 置于 25mL 量瓶中，甲醇定容，0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液为供试品溶液。

二、实验方法

1、色谱条件 Aglient ZORBAX SB-C18 柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为 0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），采用梯度洗脱方式，柱温 35℃，流速 1mL/min，检测波长为 280nm，分析时间为 60min，进样量 10μL。梯度洗脱程序见表 3。

2、质谱条件 电喷雾电离(ESI)，离子源干燥气温度200℃，雾化0.8Bar氮气，毛细管电压 4kV，干燥气体积流速 8L/min，全扫描质谱范围m/z50-2000，正离子模式获得电离质谱图。HPLC-MS 图见图 8。

三、实验结果

HPLC-MS 技术采用高效液相色谱法进行流动性梯度洗脱，联合高分辨液质联用仪对样品进行检测。从图 2 可见，用 HPLC 技术可分离出参七抗癌散抗肿瘤有效物质部位的 27 个色谱峰，结合图谱信息，比对质谱特征，综合 CA 库和文献，可初步确定 8 个活性成分结构，结果表明，参七抗癌散氯仿萃取物中含有 3 - pyridine carboxylic acid, 相对含量为 3.25%；barbatin C, 相对含量为 10.059%；asperulosidic acid, 相对含量为 9.076%；deacetylasperuloside, 相对含量为 10.89%；2 -cyclohexene - 1 - ketone, 相对含量为 3.25%；scutebarbatine F, 相对含量为 1.62%； barbatine D，相对含量为 4.21%； scutebarbatine G，相对含量为 1.70%。综合分析可知，已鉴别成分显示该萃取物这 8 个化合物主要来源于半枝莲和白花蛇舌草，且有文献报道对多种癌细胞有抗肿瘤作用，图谱中还有余下 19 个峰单靠液相色谱-质谱联用技术无法鉴定，有待于采用其他技术进行进一步研究确定。总离子流色谱图见图 9，具体化学成分分析见表 4。

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结语与创新

本学位论文通过学科交叉的研究方法，采用现代科学技术对参七抗癌散医院制剂的有效物质和作用机理进行了较系统研究，诠释了该医院制剂的药效物质基础，为其临床疗效提供了科学依据，并为进一步将其开发成创新中药品种奠定了一定基础。其创新性体现在以下几个方面：

1. 以临床疗效为依据，在中医药理论指导下，将参七抗癌散组方视为整体，通过中药化学、分析化学、分子生物学等学科交叉的研究方法，筛选出该中药复方抗癌有效物质部位和有效成分，探讨了该医院制剂什么物质有效和为什么有效，并结合组方中各中药的主治功效分析，根据多成分、多靶点的现代医学观点，本项研究为中医药配位协同作用的传统理论提供了科学实验依据。

2. 在确定参七抗癌散有效物质部位基础上，采用现代分子生物学技术对其主要有效物质的抗癌作用机理进行了研究，表明其作用机制是通过抑制 PI3K/AKT/mTOR 信号通路，诱导细胞自噬和凋亡，从而明确了该中药复方为什么抗癌有效。这对于诠释参七抗癌散的药效物质基础具有重要意义，从而为该医院制剂进一步深入研究和开发创新中药品种奠定了基础。

3. 首次发现了化合物 SS-6(3β,16β,23-三羟基-13,28-环氧乌苏-11-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)对人肺腺癌 A549 细胞有抑制作用，并可诱导人肺腺癌 A549 细胞凋亡，同时通过检测 PI3K/AKT/mTOR 信号通路蛋白表达和自噬相关蛋白表达的研究方法，探讨了该化合物诱导 A549细胞自噬性死亡的分子机制。表明该化合物对人肺腺癌 A549 细胞具有显著药效作用，从而为开发创新抗癌化学药物提供了目标化合物。

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参考文献（略）