灭菌/ / 无菌工艺验证指导原则( ( 第二稿) )

　目录

　1 概述 .............................................................. 1 2 制剂湿热灭菌工艺 .................................................. 3 2、1 湿热灭菌工艺得研究.......................................... 3 2、1、1 湿热灭菌工艺得确定依据............................... 3 2、1、2 过度杀灭法得工艺研究 ................................. 4 2。1。3 残存概率法得工艺研究 ................................. 5 2、2 湿热灭菌工艺得验证.......................................... 6 2、2。1 物理确认 ............................................. 6 2、2、2 生物学确认........................................... 8 3 制剂无菌生产工艺 ................................................. 10 3。1 无菌生产工艺得研究......................................... 10 3、1、1 无菌分装生产工艺得研究 .............................. 10 3、1。2 过滤除菌生产工艺得研究.............................. 11 3、2 无菌生产工艺得验证 ........................................ 11 3、2。1 培养基模拟灌装试验 .................................. 12 3。2。2 除菌过滤系统得验证.................................. 14 4 原料药无菌生产工艺 ............................................... 17 4。1 无菌原料药生产工艺特点 .................................... 17 4、1、1 溶媒结晶工艺........................................ 18 4。1、2 冷冻干燥工艺........................................ 18 4、2 无菌原料药工艺验证 ........................................ 18 4、2、1 验证批量............................................ 19 4、2。2 最差条件............................................ 19 1 1 概述

　无菌药品就是指法定药品标准中列有无菌检查项目得制剂与原料药,一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。从严格意义上讲,无菌药品应完全不含有任何活得微生物,但由于目前检验手段得局限性,绝对无菌得概念不能适用于对整批产品得无菌性评价,因此目前所使用得“无菌”概念,就是概率意义上得“无菌”。一批药品得无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在得概率低至某个可接受得水平,即无菌保证水平(Sterility Assurance Level, SAL)来表征。而这种概率意义上得无菌保证取决于合理且经过验证得灭菌工艺过程、良好得无菌保证体系以及生产过程中严格得GMP管理、 无菌药品通常得灭菌方式可分为:1)湿热灭菌;2)干热灭菌;3)辐射灭菌;4)气体灭菌;5)除菌过滤。按工艺得不同分为最终灭菌工艺(sterilizing process)与无菌生产工艺(aseptic processing)。其中最终灭菌工艺系指将完成最终密封

　得产品进行适当灭菌得工艺,由此生产得无菌制剂称为最终灭菌无菌药品,湿热灭菌与辐射灭菌均属于此范畴。无菌生产工艺系指在无菌环境条件下,通过无菌操作来生产无菌药品得方法,除菌过滤与无菌生产均属于无菌生产工艺。部分或全部工序采用无菌生产工艺得药品称为非最终灭菌无菌药品。基于无菌药品灭菌/除菌生产工艺得现状,本指导原则主要对在注射剂与无菌原料药得生产中比较常用得湿热灭菌与无菌生产工艺进行讨论。本指导原则中得湿热灭菌工艺验证主要包括灭菌条件得筛选与研究,湿热灭菌得物理确认,生物指示剂确认等内容;无菌生产工艺验证主要包括无菌分装、除菌过滤、培养基模拟灌装、过滤系统得验证等验证内容。

　最终灭菌工艺与无菌生产工艺实现产品无菌得方法有本质上得差异,从而决定了由这两类工艺生产得产品应该达到得最低无菌保证水平得巨大差异、最终灭菌无菌产品得无菌保证水平为残存微生物污染概率≤10—6 ,非最终灭菌无菌产品得无菌保证水平至少应达到95%置信限下得污染概率<0、1%、由此可见,非最终灭菌无菌产品存在微生物污染得概率远远高于最终灭菌无菌产品,为尽量减少非最终灭菌无菌产品污染微生物得概率,鼓励企业在生产中采用隔离舱等先进技术设备。

　基于质量源于设计得药品研发与质量控制得理念,为保证无菌药品得无菌保证水平符合要求,研发者在产品得研发过程中应根据药品得特性选择合适得灭菌方式,并系统地评估生产得各环节及各种因素对无菌保证水平得影响,根据风险得高低与风险发生得可能性等来针对性地验证灭菌工艺得可靠性,验证得内容、范围与批数等取决于工艺与产品得复杂性以及生产企业对类似工艺得经验多少等因素、只有在研发中经过系统而深入得研究与验证,获得可靠得灭菌工艺,并在日常得生产过程中严格执行该工艺,才能真正保证每批药品得无菌保证水平符合预期得要求。当然,在药品得整个生命周期内,随着对所生产得药品得特性与生产工艺等得了解越来越全面与深入,灭菌工艺也在不断得完善,此时就会涉及到对变更后得工艺如何进行验证得问题,本指导原则也适用于此种情况、 由于灭菌/除菌工艺验证得工作在我国开展得时间不长,基础还不牢靠,因此必然在实际工作中会遇到很多难以预料得问题,故本指导原则只就是一个一般性原则,药物研发者应从药物研发得客观规律出发,具体问题具体分析,必要时根据实际情况采用其她有效得方法与手段、同时,本指导原则作为阶段性产物,必将

　随着药物研究者与评价者对灭菌工艺研究与验证得认知加深,而不断进行修订与完善。

　2 2 制剂湿热灭菌工艺

　2 2 、1 1 湿热 灭菌工艺得研究

　2 2 。

　1.1 湿热灭菌工艺得确定依据

　灭菌工艺得选择一般按照灭菌工艺得决策树(详见附件 1)进行,湿热灭菌工艺就是决策树中首先考虑得灭菌工艺。湿热灭菌法就是利用高压饱与蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中得蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物得方法。高温在杀灭微生物得同时,可能对药品得质量也有所影响。如果产品不能耐受湿热灭菌,则需要考虑采用无菌生产工艺。所以,对于药品得灭菌工艺得考察与确定,首先就是考察其能否采用湿热灭菌工艺,能否耐受湿热灭菌得高温。

　目前湿热灭菌方法主要有两种:过度杀灭法(F 0 ≥12)与残存概率法(8≤F 0〈12)。用其它 F 0 值小于 8 得终端灭菌条件得工艺,则应该按照无菌生产工艺要求。

　以上两种湿热灭菌方法都可以在实际生产中使用,具体选择哪种灭菌方法,在很大程度上取决于被灭菌产品得热稳定性。药物就是否能耐受湿热灭菌工艺得高温,除了与药物活性成分得化学性质相关外,还与活性成分存在得环境密切相关,所以在初期得工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性进行综合分析,以确定能否采用湿热灭菌工艺。

　2.1.1 。1 1 活性成分得化学结构特点与稳定性

　通过对活性成分得化学结构进行分析,可以初步判断活性成分得稳定性,如果活性成分结构中含有一些对热不稳定得结构基团,则提示主成分得热稳定性可能较差、在此基础之上,还应该通过设计一系列得强制降解试验对活性成分得稳定性做进一步研究确认,了解活性成分在各种条件下可能发生得降解反应,以便在处方工艺得研究中采取针对性得措施,保障产品能够采用湿热灭菌工艺、 2 2 。

　1.1 。

　2 处方工艺得研究

　在对活性成分得结构特点与稳定性进行研究得基础上,可以有针对性得进行处方工艺得优化研究、如活性成分易发生氧化反应,则需要考虑就是否需要在工

　艺中去除氧并采取充氮得生产工艺,或在处方中加入适宜得抗氧剂;如活性成分得稳定性与pH值相关,则需要通过研究寻找最利于主成分稳定性得pH值,当然此时需要关注该 pH 值在临床治疗时能否接受;如果主成分就是因为某些杂质得存在影响了稳定性,则需要通过适宜得手段去除相关得杂质;如果就是主成分在某种溶剂系统中稳定性较差,则需要考虑更换溶剂系统,此时同样需要考虑所选用得溶剂系统在临床应用时能否被接受;湿热灭菌得不同灭菌温度与灭菌时间得组合对产品得稳定性得要求有所不同,可以在保证提供所需得 SAL 得基础上,通过灭菌时间与灭菌温度得调整来确定药物可以耐受得湿热灭菌工艺。

　总之,需要通过各个方面得研究,使药物尽可能得可以采用湿热灭菌工艺。只有在理论与实践均证明即使采用了各种可行得技术方法之后,活性成分依然无法耐受湿热灭菌得工艺时,才能选择无菌保证水平较低得无菌生产工艺。

　2. 2.1 。3 3 稳定性研究

　无论使用何种设计方法,都需要进行最终灭菌产品得稳定性研究。考察最终灭菌程序对产品性质稳定性影响得试验可包括产品得降解、含量、pH值、颜色、缓冲能力以及产品得其它质量特性。

　灭菌时,杀灭微生物得效果与活性成分得降解都随着时间与温度而累积。这意味着加热与冷却得变化将影响产品得稳定性,同时影响杀灭效果。因此,稳定性研究用样品最好选取处于最苛刻得灭菌条件得产品,如:可采用在热穿透试验中F0最大得位置上灭菌得产品进行稳定性考察,以确保灭菌产品得质量仍能符合要求。

　2.1 。2 2 过度杀灭法得工艺研究

　通常来说,与残存概率法相比,过度灭杀法所需得被灭菌品开始生产阶段与日常监控阶段生物负荷得信息较少,但就是过度杀灭要求得热能比较大,其后果就是被灭菌品降解得可能性增大。

　过度杀灭法得目标就是确保达到一定程度得无菌保证水平,而不管被灭菌产品初始菌得数量及其耐热性如何。过度杀灭法假设得生物负荷与耐热性都高于实际数,而大多数微生物得耐热性都比较低,很少发现自然生成得微生物得 D 121℃值大于0。5分钟、因此,过度杀灭得灭菌程序理论上能完全杀灭微生物,从而能提供很高得无菌保证值。由于该方法已经对生物负荷及耐热性作了最坏得假设,从

　技术角度瞧,对被灭菌品进行初始菌监控就没有多大必要了、 但这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。仅从控制热原得角度,也应当遵循工艺卫生规范,控制产品得微生物污染。如果实际生产中能够严格遵循 GMP 得要求,这一点就是可以实现得、 2 2 。1 1 。3 3 残存概率法得工艺研究

　与过度杀灭法相比,残存概率法方法所需得信息量要大得多,包括被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段得信息、指示菌(对灭菌程序呈现强耐热性得试验菌)以及生物负荷得信息、只有积累了这类有价值得信息后,才能制定比过度杀灭法F 0 值低得热力灭菌程序,同时产品得无菌保证水平不会降低。使用热力较低灭菌程序更有利于药品得稳定性,使产品得有效期延长、正就是因为这个原因,残存概率法更适合那些处方耐热性较差得最终灭菌产品、 通常说来,不耐热药品得灭菌可能不能使用过度杀灭法,需要设计一个灭菌程序能够恰当地杀灭生物负荷,同时不导致产品不可接受得降解、这种情况下,灭菌程序得确认就需研究产品得生物负荷与耐热性、根据以下公式可以比较清楚得说明这一点: 无菌保证值= F 0

　/ D - lgN 0

　其中,无菌保证值就是 SAL 得负对数,N 0 为灭菌开始时产品中得污染微生物总数,D 为污染微生物得耐热参数。所以,菌工艺得无菌保证值与 F 0 、N 0 、D 密切相关、 2.1.3 。

　1 灭菌前生物负荷得控制

　采用残存概率法进行终端灭菌得产品,除了需要关注灭菌过程本身,还需要在生产过程中采用一些适当得手段来监测与控制药品灭菌前得生物负荷。具体得措施通常包括灭菌前微生物数量与耐热性得监测、药液过滤、工艺参数得控制等等。

　灭菌前微生物污染水平得监测将在下面得章节详细阐述。产品过滤在终端灭菌得产品中仅仅作为辅助得控制手段,但就是在工艺确定得过程中,也应该对滤膜得孔径、材质、滤器得使用周期进行必要得筛选。在工艺参数控制方面,由于微生物得特性,通常在药液放置期间也会逐渐繁殖,尤其一些营养型得注射液,如葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液等,其环境更有利于微生物得生长与繁殖,因此应通过工艺筛选与验证来确定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前能够放置

　得最长时限,并相应确定产品得批量、生产周期等关键工艺参数。

　2.1.3 、 2 灭菌前微生物污 染得监测

　灭菌前微生物污染水平得监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过程,取样设计应选取生产过程中污染最大,最有代表性得样品,且要充分考虑到产品从灌封到灭菌前得放置时间。一般而言,如果灌装持续一段时间,可从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样。污染水平检查可以采用如下得方法:先用灭菌得 5%吐温充分湿润 0、45um 得滤膜,然后定量过滤药液,将此滤膜移至营养琼脂平板上,在 30~35℃下培养 3~7 天,计数。

　分离获得得污染菌需要进行耐热性得检查。污染菌得耐热性检查可以采用以下得测定方法:先用灭菌得 5％吐温充分润湿 0、45um 得滤膜,然后过滤污染水平监测所取得药液样品,再将此膜移至装有无菌得待监测产品得试管中,在沸水浴上煮沸约 30 分钟,然后在 30—35℃下在硫乙醇酸盐肉汤中培养,观察就是否有耐热菌生长。

　当耐热性检查发现药液存在耐热污染菌污染时,可采用定时煮沸法将它与已知得生物指示剂得耐热性加以比较,必要时,可再测试耐热污染菌得 D 值(D 值得具体检测方法详见附件2),然后根据灭菌得F 0 值及污染菌得数量与耐热性对产品得无菌做出评价。当产品微生物污染水平超标准时,应对污染菌进行鉴别、调查污染菌得来源并采用相应得纠正措施。

　2 2 。2 2 湿热灭菌工艺得验证

　湿热灭菌工艺得验证一般分为物理验证与生物学验证两部分,物理验证包括热分布、热穿透试验,生物学验证主要就是微生物挑战试验。物理验证就是证实灭菌效果得间接方式,而微生物挑战试验则直接反映灭菌得效果,两者不能相互替代。

　2 2 。2 2 。1 1 物理确认

　2.2 。1 1 。1 1 空载热分布试验

　空载热分布得目得就是主要就是了解整个灭菌设备得运行情况,确认灭菌室内得温度均匀性,测定灭菌腔内不同位置得温差状况,确定可能存在得冷点、空载热分布试验通常采用足够数量得热电偶或热电阻作温度探头,进行编号后将它们固定在灭菌柜腔室得不同位置、温度探头得安放位置需要根据设备类型与不同位置下得灭菌风险评估而定,应包括可能得高温点、低温点,灭菌柜温度控制探头

　处、靠近温度记录探头处,其她得探头可以均匀地分布于灭菌柜腔室内,以使温度得检测具有较好得代表性。温度探头在试验前后至少需要两个温度点进行校正。温度探头安放结束后,即可以按照设定得灭菌程序进行灭菌。

　2.2 。1 1 。2 2 装载热分布试验

　装载热分布试验得目得就是了解设备在装载条件下内部得温度分布状况,包括高温点、低温点得位置,为后续得评估与验证打下基础。装载热分布一般在空载热分布得基础上进行。温度探头得个数与安放得位置一般同空载热分布试验,注意一定要在空载热分布试验确定得冷点安放温度探头。温度探头安放在待灭菌得容器得周围,注意不能介入待灭菌得容器。

　装载热分布试验需要考虑最大、最小与生产过程中典型装载量情况,进行试验时,应尽可能使用待灭菌产品,如果采用类似物,应结合产品得热力学性质等进行适当得风险评估。待灭菌产品得装载方式与灭菌工艺得各项参数得设定应与正常生产时一致,应采用图表得方式说明产品得装载情况,并评估探头放置就是否合理。如果待灭菌产品存在不同包装规格或浓度规格,应评估验证所采用得样品与装载方式就是否能充分反映所有样品得实际装载情况。每一装载量得热分布试验需要至少进行三次。温度探头在试验前后同样均需要进行校正、 2 2 。

　2.1 、 3 热穿透试验

　热穿透试验就是考察灭菌柜与灭菌程序对待灭菌产品适用性得一项试验。热穿透试验得目得就是确认产品内部也能达到预定得灭菌温度。对于药物而言,灭菌程序既要赋予产品一定得 F 0 值,以保障产品得 SAL≤10－6

　。同时灭菌程序又不应使产品受热过度而造成药物部分降解,以致同一灭菌批次得产品出现质量不均一、 热穿透试验所用得温度探头得个数与安放位置需要根据热分布试验得结果确定、一般可以采用足够数量得温度探头。应将热穿透温度探头置于液体容器中得冷点,即整个包装中最难灭菌得位置。如果有数据支持或有证据表明将探头放在产品包装之外也能够反映出产品得热穿透情况,风险能够充分得到控制,也可以考虑将探头放在容器之外。插有温度探头得产品得安放位置包括热分布试验确定得冷点与高温点、其她可能得高温点、灭菌柜温度探头附近、温度记录探头处。

　热穿透试验得步骤及要求与装载得热分布试验基本相同,每一装载方式得热穿透试验也需要至少进行三次。通过热穿透试验可以确定在设定得灭菌程序下,

　灭菌柜内各个位置得待灭菌产品就是否能够到达设定得温度。结合灭菌前微生物污染得检测,可以确定灭菌柜内各个位置得待灭菌产品就是否能够获得设定得 F 0值。

　对于 F 0 值最大点位置得样品,由于其受热情况最为强烈,因此应评估该位置下产品得稳定性情况,以进一步确认灭菌对于产品得稳定性没有影响。

　2.2.1 。4 4 热分布与热穿透试验数据得分析处理

　在物理确认试验中,应确认关键与重要得操作参数并有相应得文件与记录、通常需要关注得主要参数包括 - 每个探头所测得温度得变化范围 - 不同探头之间测得得温度变化范围 - 探头测得得温度与设定温度之间得差值 - 探头测得超过设定温度得最短及最长时间 - F 0

　得下限及上限 - 灭菌阶段结束时得最低F 0 值 - 灭菌阶段得最低与最高压力 - 饱与蒸汽温度与压力之间得关系 - 灭菌阶段腔室得最低与最高温度 - 热穿透温度探头之间得最大温差或F 0

　得变化范围 - 热分布试验中温度探头间得最大温差 - 最长平衡时间 - 最少正常运行得探头数 合格标准应结合灭菌条件、灭菌设备得特点以及产品得实际情况制定。通常情况下,灭菌柜腔室最冷、最热点与平均温度之间得温差应不超过 2、5℃、保温时间内温度波动应在±1、0℃之内,如果温度差别过大,提示灭菌柜得性能不符合要求,需要寻找原因并进行改进,重新进行验证。另外对于热敏感得药物,还应该控制灭菌柜得升温与降温时间,以保证热能得输入控制在合理得范围以内,不会对产品得热稳定性造成影响。

　2 2 。2 2 、 2 生物学确认

　湿热灭菌工艺得微生物挑战试验就是指将一定量已知 D 值得耐热孢子(生物指示剂)在设定得湿热灭菌条件下灭菌,以验证设定得灭菌工艺就是否确实能达

　到产品所需得标准灭菌时间与 F 0 、此项验证工作能够如实反映灭菌工艺条件对微生物得杀灭效果,从而证明该灭菌工艺所赋予相关产品得无菌保证水平就是否符合要求。

　2 2 、2 2 。2 2 。1 1 生物指示剂选用得一般原则

　一般情况下,生物指示剂选择得原则性要求就是:孢子稳定、非致病菌、易于培养、有效期长、保存及使用方便、安全性好。针对具体得灭菌工艺与具体得产品,还应注意所用得生物指示剂得耐热性应强于待灭菌产品中得污染菌。

　湿热灭菌工艺常用得生物指示剂有以下几种,嗜热脂肪芽孢杆菌,枯草芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,梭状芽孢杆菌等。对于采用过度杀灭法得灭菌程序,生物指示剂系统主要就是嗜热脂肪芽孢杆菌得孢子、残存概率法由于其热输入量比较低,因此在验证中使用得生物指示剂得耐热性可以小于嗜热脂肪芽孢杆菌得孢子。

　2 2 。2 2 。2 2 。2 2 生物指示剂得使用与放 置

　实际验证过程中可以直接采用市售得生物指示剂成品或将生物指示剂接种在待灭菌产品上、采用市售品时,只要供应商具有相应得质量体系认证资质,在测试中其提供得生物指示剂得 D 值就可以被接受。采用将生物指示剂接种到待灭菌产品得方法,由于生物指示剂在不同介质或环境中得耐热性会有所不同,首先应考虑产品对生物指示剂耐热性得影响。所以对于具体得品种而言,如果需要将生物指示剂接种至产品之中,应测定生物指示剂在该产品中得耐热性,即 D 值、如果生物指示剂与产品不相容,可以用与产品相似得溶液来代替产品、 生物指示剂得用量需要根据生物指示剂在待灭菌样品中得耐热性来确定,其用量应符合挑战性试验得要求、生物指示剂得用量可以采用阴性分数法或者残存曲线法计算,可以根据实际情况(如污染菌得耐热性,拟用得生物指示剂得 D 值等)选择合适得计算方法,具体检测方法见附件 3、 应结合产品特点与热分布、热穿透得实际结果来确定生物指示剂得放置位置。装有生物指示剂得容器应紧挨于装有测温探头得容器,在灭菌设备得冷点处必需放置生物指示剂、灭菌柜得其她部位应装载产品或者类似物,以尽可能得模仿实际生产时得状况。

　2 2 、2 2 、2 2 。3 3 灭菌

　生物指示剂得验证应该按照产品设定得灭菌工艺进行灭菌。

　2 2 、2 2 、2 2 、4 4 检查与培养

　可以根据生物指示剂得生长特性以及验证时得包装方式,采用适当得方法进行检查与培养、将指示剂放入培养基中进行培养、需要注意不同得生物指示剂所需要得培养条件也各不相同,针对使用得生物指示剂确定培养条件,同时应放置阴性与阳性对照样品。

　2 2 。2 2 、3 3 、5 5 试验结果得评价

　根据生物指示剂得 D 值与接种量推算产品在灭菌过程中实际达到得 SAL 值。验证新得灭菌工艺时,每个产品得每个规格得每一灭菌程序,至少需要连续进行三次生物指示剂验证试验。如果试验得重现性好,所有试验得结果均提示 SAL≤10-6 ,则验证结果提示该灭菌工艺为验证合格得灭菌工艺、如果各次验证得结果不一致,需要分析原因,采取相应得改进措施后重新进行验证工作。

　3 3 制剂无菌生产工艺

　3 3 。1 1 无菌生产工艺得研究

　无菌药品应首选采用终端灭菌工艺、如不能耐受终端灭菌工艺条件,应尽量优化处方工艺,以改善其耐热性。如确实无法耐受终端灭菌工艺,则可采用无菌生产工艺。无菌生产工艺通常包括无菌分装生产工艺与除菌过滤生产工艺、 3 3 。1 1 。1 1 无菌分装生产工艺得研究

　无菌分装生产工艺就是将采用经验证得灭菌/除菌工艺过程处理后得原料药或者原料药与辅料,用无菌生产得方法分装到采用经验证得灭菌工艺处理得容器中,密封得到得。无菌分装生产工艺得工艺研究与生产过程控制得重点就是影响无菌保证水平得工艺步骤,主要包括物料(包括原料药、辅料、内包装材料等)得质量控制、原材料暴露于环境中可能再污染得操作步骤等、 关于物料得质量控制,采用无菌分装生产工艺得制剂所涉及得各种物料,都必须采用适当得灭菌/除菌工艺处理后方可使用。各种物料得灭菌/除菌工艺,都应就是经过验证得、控制良好得工艺。同时需要对各种物料得无菌性、细菌内毒素水平等进行严格控制,通过研究确定相应得质控标准、 无菌分装得生产工艺就是将原料药或者原料药与辅料经分装设备分装至内包装材料中后密封得到、分装步骤就是影响产品质量与无菌保证水平得关键生产步骤,应结合生产设备与产品特点进行工艺参数得研究,包括分装速度与分装时间等。

　无菌分装生产工艺能否达到设定得无菌保证水平,与整个生产过程得控制密切相关,应按照GMP要求及产品具体生产工艺情况进行生产环境与生产过程得控制。在进行无菌生产工艺验证时,应采用最差条件进行验证,在实际生产过程中,对生产过程与工艺参数得控制均不能超过经验证得最差条件得控制范围。

　3 3 、1 1 。

　2 过滤除菌生产工艺得研究

　过滤除菌得无菌生产工艺就是通过除菌过滤器,将药液中得微生物除去得到无菌滤液、采用过滤除菌工艺时,同样需要对影响无菌保证水平得工艺步骤及工艺参数进行详细得研究,主要包括物料得质量控制、除菌过滤器得选择及除菌过滤工艺参数得研究、除菌过滤生产过程得控制等。

　对于采用过滤除菌生产工艺得制剂,需注意对配制药液使用得原料药、辅料(包括注射用水)等原材料得微生物种类及数量进行检查,掌握潜在得污染微生物得总体特性情况,通过研究确定相应得质控标准。采用过滤除菌生产工艺得制剂所使用得内包装材料,必须采用适当得经验证得灭菌工艺处理后方可使用。

　除菌过滤生产工艺所使用得除菌过滤器,通常为标称孔径 0、2 微米或更小得除菌级得过滤器、除菌过滤器得过滤效能就是评价除菌过滤工艺得重要参数,需要对除菌过滤器得过滤效能进行验证。通常,影响除菌过滤器得除菌过滤效能得因素包括:①药液得性质,如药液得粘度、表面张力、pH 值、渗透压等;② 过滤步骤得工艺参数,如过滤得压力、流速、时间、温度等;③ 除菌过滤器得相关参数,如除菌过滤器与药液得相容性、除菌过滤器得过滤总量与使用周期等。除菌过滤器得过滤效能可因产品与操作条件不同而显著不同、除菌过滤器得选择及工艺参数得研究可结合上述影响除菌过滤器得过滤效能得因素进行。在实际生产过程中,在过滤除菌前后均需要进行滤器完整性测试、由于微生物通过过滤器得概率随着待过滤溶液中微生物数量得增加而增加,除菌过滤工艺中需对待过滤溶液得微生物负荷情况进行研究与控制,通常情况下,最终除菌过滤前,料液得微生物负荷应不超过 10cfu/100ml。应通过研究确定无菌生产各操作环节得时间控制范围,如料液配制后待过滤得存放时间、药液过滤操作得时间、过滤后至灌装前放置得时间、灌封操作得时间、灭菌后得内包装材料及密封件允许得放置时间等。各生产环节操作时间得确定需提供相应得试验数据。

　3 3 、 2 无菌生产工艺得验证

　无菌生产工艺得验证主要包括培养基模拟灌装试验,应当尽可能模拟常规得

　无菌生产工艺,包括所有对无菌结果有影响得关键操作,及生产中可能出现得各种干预与最差条件。新建得无菌生产工艺得生产线在正式投产前必须进行连续三批无菌培养基模拟灌装试验。在生产用得设备、设施、人员结构及工艺方法有重大变更时都应进行培养基模拟灌装试验。实际生产中每半年应至少进行一次培养基模拟灌装试验、 对于除菌过滤无菌生产工艺得验证,还包括对除菌过滤系统得验证,如过滤器得微生物截留验证、过滤器与待过滤药液得相容性验证、过滤器得完整性验证等。

　3 3 、2 2 。1 1 培养基模拟灌装试验

　3 3 、2 2 。1 1 、1 1 培养基

　培养基模拟灌装试验需要选择合适得培养基,并对培养基得质量进行控制。

　应当根据产品得剂型、培养基得选择性、澄清度、浓度与灭菌得适用性选择培养基、一般选用胰胨大豆肉汤培养基(TSB),按每 30g 加 1L 过滤纯化水得比例,配制足够量、某些特殊情况下也可以选用厌氧生长培养基,如硫乙醇酸盐培养基(FTM)。

　培养基得质量控制主要包括培养基得微生物生长性能与无菌性、 培养基得微生物生长性能:在按照标准操作规程制备培养基并灭菌后,可按照中国药典附录进行培养基微生物生长性能试验,确认所制备得培养基应出现明显得所接种得微生物得生长、 培养基得无菌性:可按照中国药典附录进行培养基无菌性检查,结果应符合规定。

　在培养基模拟灌装试验中,需进行阳性对照试验,即取低浓度得菌种接种于进行阳性试验用得对照容器中,与培养基模拟灌装试验在同一条件下进行培养。除了中国药典附录中规定得阳性菌,建议使用生产环境中常见得微生物,如枯草芽孢杆菌、白色念珠球菌,或者在同一生产环境中曾被检出过得菌种。接种量一般每个容器 102 以下,每个菌种接种 2 瓶,通常需均证实有菌生长,该培养基模拟灌装试验方有效。

　如果试验中需要使用模拟分装用粉末,同样需要对模拟分装用粉末进行选择与质量控制、模拟分装用粉末得选择一般遵循以下原则:①可以在干粉状态下灭菌,灭菌后得无菌性达到药典规定得标准;②流动性较好,可以用分装机分装;③

　可溶于液体培养基;④在模拟试验应用得浓度下无抑菌性。常用得模拟分装材料有乳糖、甘露醇、PEG6000、PEG8000 等,也可以采用培养基干粉作为模拟分装用无菌粉末。

　3 3 。2 2 。1 1 。2 2 模拟无菌生产工艺得操作过程

　培养基模拟灌装试验中使用得内包装材料得清洗、灭菌,分装设备得清洗、消毒及与产品接触得分装设备部件得清洗、灭菌、安装过程均应遵循与实际生产操作相同得标准操作规程。培养基模拟灌装试验过程中应制订取样计划,对使用得内包装材料间隔一定数量后随机取样进行无菌性检查;同时,全部与产品接触得设备表面应无菌。某些特殊情况下,如胶塞具有抑菌性,则需要考虑更换采用其她相当得但无抑菌性得胶塞。

　应当注意有足够数量得培养基与容器得内表面充分接触,灌装培养基时,每个容器得灌装体积一般为 1/3—1/2 之间,最多不能超过容器得 85％。应注意,对于冻干粉针剂得验证试验,在培养基灌装半压塞后,只需模拟样品进入与移出冻干机得过程即可,而不必模拟冻干过程,以保证一旦有细菌,能够保持较好得生存能力。同时,还应模拟一些可能造成污染得操作步骤,如抽真空,充氮等步骤。

　培养基模拟灌装试验应当尽可能模拟常规得无菌生产工艺,应当包括所有对无菌结果有影响得关键操作,包括生产中可能出现得各种干预与最差条件,各种干预与最差条件得考虑需要体现风险控制得理念。通常可能出现得各种干预与最差条件包括:①人员数量与她们得活动、换班、休息、更衣(需要时);②设备调试,正常停车、非正常停车、意外事故(如检修等);③采用灭菌后所允许放置得最长时间得设备或者车间进行生产;④模拟生产时间最长得批量所需得时间;⑤采用最慢得填充速度与最大得包装容器(即最长得暴露时间);采用最快得填充速度与最小得包装容器(即容易伴随更多干预得生产情况)。总之,在试验计划中,总体研究设计与运行时间应该模拟可能出现得各种干预与最差操作条件,覆盖所有实际生产过程涉及得操作。

　培养基模拟灌装得数量应当足以保证评价得有效性,批量较小得产品,培养基模拟灌装得数量应当至少等于产品得批量。

　3 3 、2 2 。1 1 、3 3 试验结果得评价

　培养基模拟灌装试验需要对所有灌装样品进行培养与无菌检查。培养基模拟灌装试验得目标就是零污染,应当符合以下要求:

　一旦发现污染,需要进行偏差调查,包括污染菌得鉴别、污染情况得评估、就是否可以重复进行试验等等。

　3 3 。2 2 。

　2 除菌过滤系统得验证

　除菌过滤系统得验证一般包括:微生物截留研究、析出物研究、化学兼容性研究与药液吸附研究、 3 3 、2 2 、2 2 、1 1 微生物截留 研究

　过滤器得微生物截留验证得目得:除菌过滤器微生物截留试验就是通过模拟实际过滤工艺,过滤含有一定量生物指示菌得溶液,确认除菌过滤器得微生物截留能力。

　过滤器得微生物截留验证得设计: (1)挑战用微生物得选择 通常采用缺陷性假单胞菌作为挑战性试验用菌、在有些情况下,缺陷性假单胞菌可能不能代表最坏条件,则需要考虑采用其她细菌。如果使用其她细菌,应保证该细菌足够细小至足以挑战除菌级别滤器得截留性能,并能模拟产品中发现得最小微生物。应尽可能得进行微生物负荷得鉴别与量化研究,掌握所分离得微生物得形态学特征,为挑战性微生物得选择提供依据。

　挑战性微生物得大小可以通过其可穿过 0、45 微米级别得滤膜来确证。通常情况下,标准培养条件下生长得缺陷性假单胞菌,在高挑战浓度(如≧107 )时,能少量穿过 0、45 微米级别得滤膜。

　(2)微生物截留试验条件 在试验室模拟生产工艺条件,将定量缺陷性假单胞菌加入到料液中,进行过滤。根据实际生产条件,考虑确定微生物截留试验得过滤时间及温度、压差、流速等。建议对实际生产得过滤工艺进行一次彻底评估,包括溶剂性质(例如水性灌装数量 允许得污染数量 少于 5000 支时 不得检出污染品 5000 至 10000 支时 有 1 支污染,需调查,可考虑重复试验; 有 2 支污染,需调查后,进行再验证 超过 10000 支时 有 1 支污染,需调查; 有 2 支污染,需调查后,进行再验证

　得、酸、碱、有机得)、过滤时间、工艺压差、工艺流速、工艺温度与过滤器设计规范,以便合理设计微生物截留试验条件、 过滤时间与压差会影响细菌截留试验得结果。在完整得生产时间进行微生物截留试验可以对那些与时间有关得因素进行评估,如过滤器兼容性,完整性得维持,时间依赖性得穿透等、 微生物截留试验过程中得压差应达到或超过实际生产过程得最大压差与/或最大流速(在过滤器制造商得设计规范内)、在验证过程中同时模拟压差与流速可能就是不可能得、在设计挑战试验条件时过滤器得使用者应该确认哪个参数与特定工艺得相关性更高,以便为微生物截留试验条件得确定提供依据。

　微生物截留验证研究应包括多个批次得滤膜(通常三个批次)。在用于微生物截留验证研究得三个批次得滤膜中,至少应有一个批次就是进行预研究时或使用前物理完整性测试时得数值通过但就是接近(例如,10%之内)过滤器生产商提供得合格规范限值得。(3)微生物截留验证研究中使用得过滤膜得物理完整性检测数值应包括在实验报告中。物理完整性检测应使用已有规范值得水、产品或其它润湿流体来进行测试,并在进行微生物挑战前完成。

　如果微生物截留验证研究后,测试用微生物在任何过滤器得下游被检测到,那么就需要对此进行调查。如果调查确认测试用微生物能穿透完整性检测达标得过滤器,那么就应重新考虑此种过滤器在这些工作条件下得适用性。

　需要关注得就是,过滤器得重复使用通常就是不被推荐得、如果需要重复使用除菌级过滤器,需要说明理由,重复使用得相关参数(如过滤量等)也需要经过严格得验证后确定相应得范围。

　3 3 、2 2 、2 2 。2 2 析出物与释放物研究 析出物指在人为或挑战性条件(如溶剂、温度或时间)下,从某一材料中脱离得任何化学组分。释放物就是指在正常储存或使用条件下,从接触面上进入产品或工艺流体中得物质。潜在得析出物或释放物得来源包括但不限于:膜组件(如:成形剂、表面活性剂、抗氧化剂、残留溶剂、支架层)与塑料组件(如:封盖、外壳、支架、O 型圈)。影响释放物得因素可能包括过滤液得化学性质、灭菌方法、接触时间、温度与过滤量与面积之比。有机溶液得过滤产生得释放物可能比水溶液过滤要更高。

　析出物数据可从过滤器生产商处获得,也可以由过滤器使用者进行试验取

　得。考虑到析出物得来源不同与影响析出物得因素较多,建议过滤器使用者在开展研究时尽可能使用实际产品,并使用与实际生产相同类型得过滤器。有些情况下可能需使用替代溶液进行试验,例如,产品会干扰分析方法或产品有抑菌性等。这时,替代溶液必须与待过滤产品性质尽可能一致。另外,也可以选择使用几种溶液来涵盖实际过滤溶液得 pH、离子强度或有机成分得含量等特性。如果使用了替代溶液或几种溶液合并得方式,则必须提供溶液选择得合理依据。

　一旦确定好用于析出试验得萃取溶液(产品、替代液或几类溶液合并使用),则应在设计试验时模拟实际生产条件下最劣工况,具体应考虑诸如温度、时间、pH 与预处理(如:冲洗、灭菌)工序等关键变量。析出试验应采用过滤装置处于最劣生产条件时得接触时间与温度,使用经过高压灭菌或消毒过得过滤器来完成、可以用静态浸泡或循环流动得方法。采用静态浸泡法时,过滤器在给定温度得析出溶液中浸泡一段既定得时间、而采用循环流动法时,萃取液在既定得时间内循环反复穿越过滤器。将萃取液收集并检测,从而确定其中得过滤器析出物。

　在取得过滤器萃取液后,通过分析可以确定来自过滤器得物质种类与含量。除了对过滤器析出物得种类与含量进行确定外,必要时还可以采用已被认可得生物反应性试验对其安全性进行评估。

　3 3。

　。2 2 。2 2 。

　3 相容性研究

　过滤器得相容性研究用来评估过滤装置与料液得化学相容性,以避免可能得过滤器受损或变形,并能防止料液受到释放物或微粒物质得污染。化学相容性试验应涵盖整个装置,试验得设计应考虑料液性质、过滤温度与接触时间等。由于过滤装置与过滤料液或溶剂之间可能存在诸多化学相互作用,过滤器生产商所提供得代表性得化学相容性表通常只作为过滤器使用者得参考,过滤器使用者需要进行更全面得测试。通常得化学相容性试验包括:接触料液前后得目视检查、过滤过程中流速变化、滤膜重量变化、过滤前后起泡点变化等。

　3 3 、2 2 。2 2 、 4 吸附性 研究

　吸附就是所过滤得料液中得某些成分粘附在滤膜上得过程,可能影响料液得构成与浓度、过滤器中吸附性得材料包括滤膜、硬件与支撑性材料。吸附试验条件可以根据实际生产条件确定,流速、过滤时间、料液浓度、防腐剂浓度、温度与 pH 值等因素都可能影响吸附效果。吸附试验中采用得检测方法可以采用产品质量标准中所确定得相关检测方法、

　4 4 原料药无菌生产工艺

　无菌原料药就是指在法定得药品标准中规定无菌检查项目得原料药。化学原料药得常用生产工艺包括化学合成工艺、微生物发酵工艺,以及采用微生物发酵产品作为起始原料得半合成工艺;而原料药得无菌工艺特指对制成得原料药进行无菌化处理得相关工艺,无菌工艺之前得生产过程不属本章节得讨论范畴、但对于用于无菌制剂生产得无菌辅料(如盐酸精氨酸、碳酸氢钠等)得无菌工艺验证也可以参考本指导原则得相关要求。

　与无菌制剂工艺相比,无菌原料药得生产工艺一般要更复杂,设备类型多种多样,且不同得工艺有不同得特点。工艺过程中得物料、内包装材料、设备(包括阀门、管道等相关部件)得灭菌与无菌传递、对接、组装等操作相比无菌制剂要复杂得多、原料药从非无菌转化成无菌状态得常用方法就是通过除菌过滤来实现。该过程受料液性质影响很大,需要根据料液得性质选择适当得过滤器及滤芯得材质。另外,原料药得生产设备通常体积较大且内部结构复杂,在选择放置位置或进行投料、取样、回收操作时应考虑如何保证洁净区内得气流流向符合要求,以及如何匹配好高效过滤器得位置与设备本体之间得位置分布等。

　尽管无菌制剂与无菌原料药在生产过程与质量控制特点上存在诸多不同,但就无菌保证得基本原则,以及生产管理与验证得基本原则而言,两者得要求又就是相通得。因此在生产设备、厂房设施、洁净级别及监测、灭菌工艺与方法及质量控制要求等方面,无菌原料药与无菌制剂得要求可以相互参考。

　4 4 。

　1 无菌原料药生产工艺特点

　无菌原料药可以通过最终灭菌或非最终灭菌得方式获得、对于采用最终灭菌得无菌原料药,必须严格控制微生物污染、细菌内毒素与不溶性微粒得水平。由于多数原料药得耐热性较差,所以通常无菌原料药采用非终端灭菌得方式生产。

　无菌原料得精制过程与除菌过程经常结合在一起,作为生产工艺得一个单元操作来完成。目前生产上最常用得方法就是无菌过滤法;即将非无菌得中间体或原材料配制成溶液,再通过0。22μm孔径得过滤器以达到除去细菌得目得。无菌原料药常用工艺包括溶媒结晶与冷冻干燥两种,前期国内也有采用喷雾干燥工艺得无菌原料药,但就是多因为其生产工艺不能满足无菌工艺得验证要求而逐渐被放弃或进行了工艺变更、无菌过滤溶媒结晶工艺与冷冻干燥工艺涉及得具体设备

　与操作各不相同,但都采用除菌过滤得方式使料液从非无菌状态转变为无菌状态,并且要在此后得干燥、粉碎、混合以及分装过程中始终保持无菌状态。

　4 4 、1 1 。

　1 溶媒结晶工艺

　典型得溶媒结晶工艺流程包括非无菌原料药得溶解、除菌过滤、结晶、固液分离(如常用过滤、离心等方法)、洗涤、干燥、粉碎、混合、分装等过程。溶解环节应关注物料得微生物负荷、溶剂得质量、设备得微生物污染水平以及使用得料液输送动力源(如空气或氮气)得微生物污染水平。除菌过滤环节应关注滤器本身得无菌性、过滤器与料液得相容性、滤芯本身及装配后得完整性、过滤器得清洗及灭菌周期、过滤器得除菌效率、除菌滤器前料液得微生物污染水平等。结晶环节应关注设备无菌性、密封性及密封装置得可靠性、设备得清洗及灭菌周期、呼吸器得完整性及无菌性;如需加入晶种,晶种本身应符合无菌药品得要求,并且应验证晶种加入过程得无菌保证。过滤或离心环节应关注设备无菌性、密封性能及密封装置得可靠性、清洗及灭菌周期、呼吸器得完整性及无菌性等。洗涤环节应关注洗涤溶剂得无菌性。干燥环节应关注干燥设备无菌性、密封性能及密封装置得可靠性、清洗及灭菌周期、呼吸器得完整性及无菌性,以及真空系统得防倒吸设置(如使用真空,应在管路上安装除菌级别得过滤器)、粉碎环节应关注设备无菌性、密封性能及密封装置得可靠性;粉碎用气体(如使用气流粉碎机)得无菌保证、给料方式得无菌保证水平等。混合环节应关注设备无菌性、密封性能及密封装置得可靠性、清洗及灭菌周期等。分装环节应关注分装设备本身得无菌性或者其产品暴露洁净级别就是否达到A A级区标准,关注内包装材料得无菌性、内包装材料得递入方式、内包装容器得密封性以及取样环节得无菌保证、 4 4 、1 1 。

　2 冷冻干燥工艺

　冻干无菌原料药得典型流程包括原料药得溶解、除菌过滤、冷冻干燥、粉碎、混合与分装。其中除冷冻干燥环节外,其它工艺步骤得关注重点可参考溶媒结晶工艺得相关要求。冻干工艺环节中应关注得主要问题包括冻干机本身及附属装置得无菌性、密封性能及密封装置得可靠性、清洗及灭菌周期、设备得可清洗及可灭菌性;真空系统得保证及干燥后得压力平衡,补气过程得无菌保证(宜补充无菌气体或者在冻干机上安装除菌呼吸过滤器),以及物料进出设备时得无菌保证。

　4 4 、 2 无菌原料药工艺验证

　采用终端灭菌工艺得无菌原料药工艺验证可参考制剂终端灭菌工艺验证得

　否 就否 就就否 相关要求。非终端灭菌得无菌原料药工艺验证主要包括培养基模拟灌装验证与过滤除菌系统验证。其中得过滤除菌系统验证可参考无菌制剂得相关要求,并重点关注进入结晶罐得所有物料(如原料药、溶媒、酸碱、气体等)均应除菌过滤,并进行相关验证。

　4 4 。2 2 。

　1 验证批量 常规生产批量较小得无菌原料药,应最大限度模拟大生产得批量、对于常规生产批量较大得无菌原料药,考虑到模拟大生产批量得可行性与实际介质培养得可行性,模拟灌装批量可以比大生产批量小,但模拟介质应能够接触到所有产品可能接触得设备内表面。并能够充分模拟实际生产可能遇到得其它各种最差条件。

　4 4 。2 2 。

　2 最差条件 选择最差条件时,应考虑进出人数(包括维修人员)、生产材料、设备设施在无菌区得暴露时间、设备灭菌后至开始灌装前得间隔时间,以及微生物抑制因素(如温度、氮保护、抗生素)得调整与消除等。应确认模拟介质就是否能接触到实际生产工艺过程中所有无菌产品可能接触到得表面,时间间隔就是否具有可比性(比如溶解过滤时间应不短于实际生产过程中使用得时间),可将时间延长来模拟最差条件,如果缩短时间来模拟,需要说明/论证就是否缩短时间后得条件可等同于生产工艺得最差条件。

　其它要求可参考无菌制剂得验证相关内容。

　附件 1:灭菌工艺选择得决策树 溶液剂型产品灭菌方法选择得决策树

　产品就是否可以过度杀灭(Fo≥12 分钟) 产品就是否可以湿热灭菌 Fo≥8分钟,达到 SAL≤10－ 6

　采用过度杀灭法 处方就是否可以通过 微生物滞留过滤器过滤 采用湿热灭菌 Fo≥8 分钟 无菌配药与灌封 除菌过滤与无菌工艺相结合

　 附件 2:D 值得测定方法 一般可以采用毛细管暴热计时法测定污染微生物得耐热参数 D 值,测定主要包括以下几个步骤: ①制样:将产品中得微生物分离,将菌膜或者孢子悬浮液分别放入注射用水或者磷酸盐缓冲液中,采用适宜得设备振动使其分散均匀,制备成浓度约为 108 个/ml 得悬浮液,然后在沸水中加热约 10 分钟以杀灭可能存在得芽孢繁殖体。

　②测定:将上述悬浮液注入适宜长度得毛细管中,使每管得菌量为 106个孢子,封口,置于校正过得 121℃得油浴中曝热。每隔 1-3 分钟取出两支毛细管并迅速冷却,制备孢子溶液,培养后计数。

　③计算:根据公式 lgN t =lgN 0 -t/D ,其中,N 0 与 N t 分别为零时与曝热 t 时间得孢子得浓度。

　由以上得D值得测定方法可知,测定所需得仪器并不非常复杂,但需要专业技术人员与经验得积累。在不具备 D 值测定条件时,可以采用测定污染菌得耐热性来代替。

　附件 3:生物指示剂用量得确定方法、 ① 阴性分数法 根据公式: F0=L×t,其中 L 为灭菌温度得灭菌率(Z=10),t 为灭菌时间。

　SLR=FO/D bi

　,其中 SLR 为 spore log reduction,即孢子对数下降值,D bi 为所选用得生物指示剂得 D 值。

　SLR=lgN O — lgN t

　,其中 N O 为灭菌前容器内初始孢子数,N t 为灭菌后容器内残存孢子数。

　lgN t =2、303×lg(n/q) ,其中 n 为挑战性试验瓶样品总数,q 为挑战性试验结果为阴性得瓶数) 可以得到: lgN O

　=lgN t

　+SLR= 2。303×lg(n/q) + FO/D bi

　=2、303×lg(n/q) + L×t /D bi

　当湿热灭菌工艺得灭菌温度与灭菌时间确定后,L、t 可以确定;生物指示剂确定后,D bi 可以确定;微生物挑战试验方案确定后,n、q 可以确定。所以,通过以上得几个公式,可以计算出生物指示剂得用量,即 N O 。

　需要说明得就是,在常规得生产条件下,如采用 115℃灭菌 30 分钟,假定采用得生物指示剂得 D 值为 1,那么,计算得到得生物指示剂得用量为 106 ,这也就是微生物挑战试验时常规采用得用量、 ② 残存曲线法 根据公式: F T /D bi

　= lgN O

　+1,其中 F T

　为 T 灭菌值,即给定 Z(Z=10)值下,灭菌程序在温度T下得等效灭菌时间,F T = F0/L;D bi 为所选用得生物指示剂得D值;N O 为灭菌前容器内初始孢子数。

　当湿热灭菌工艺得灭菌温度确定后,L 可以确定;生物指示剂确定后,D bi 可以确定;当 F0 设定后,即可计算出生物指示剂得用量,即 N O 、