药学论文：赤芍降血糖作用研究

第一章 赤芍体外生物活性研究

前言

有学者研究赤芍水提液对 α-葡萄糖苷酶的抑制作用，结果显示赤芍水提液体外对 α-葡萄糖苷酶无抑制作用[9]或弱抑制作用[10]。但未见赤芍醇提物对 α-葡萄糖苷酶抑制活性研究。本章主要对赤芍醇提取物抑制 α-葡萄糖苷酶的活性进行研究。

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1.1 赤芍不同提取部位体外对α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

1.1.1 仪器、试剂和材料

a: 仪器

全波长酶标仪 (Thermo)；LRH-150 恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)；DELTA320 型 PH 计 (美国 Mettler-Toledo 公司)；电子天平 (美国 Mettler-Toledo公司)；旋转蒸发仪 (Heidolph)；不同规格移液器及枪头；96 微孔板；不同规格玻璃器皿。CS-H1 型混合器 (北京博励阳有限公司)。

b: 试剂

α-葡萄糖苷酶 (Sigma 公司，批号)，对-硝基苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷 (PNP-G，Sigma 公司，批号 ，磷酸盐缓冲液 (PH 6.8)，阿卡波糖(拜糖平，Sigma 公司，批号 100434 )，其它试剂均为分析纯。

c: 样品来源

氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、赤芍内酯苷、芍药苷、原儿茶酸和五没食子酰葡萄糖由河南大学中药研究所提供。

赤芍饮片购买于开封市乐仁堂药店，产地为内蒙古赤峰市，由河南大学中药研究所李昌勤教授鉴定为毛茛科植物赤芍 ( Paeonia lactiflora Pall. )的干燥根。标本存于河南大学中药研究所。

将赤芍饮片 (1.9 Kg) 粉碎，在用70%乙醇加热提取2次，每次2 h，合并滤液，减压浓缩得总浸膏 (570 g，得率30%)。将浸膏分散于少量水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩得石油醚部位 (6 g，得率1.05%)，乙酸乙酯部位 (29 g，得率5.09%)，正丁醇部位 (81.3 g，得率14.26%)。

1.1.2 方法

a: α-葡萄糖苷酶活力测定

根据反应体系：112 μL 磷酸钾缓冲液 (pH= 6.8)，加入 20 μL 0.2 U/mL-1α-葡萄糖苷酶20 μL，8 μL DMSO，37 ℃恒温孵育15 min后加入2.5 mmoL/mL PNPG20 μL，摇匀，37 ℃恒温反应 15 min，再加入 80 μL 0.2 moL/mL 的 Na2CO3溶液，混匀后于 405 nm 波长下测量吸光度值。

b: 样品测定

实验共设 5 个组，每组 3 孔：分别为：a、对照组 (缓冲液+酶液+底物)；b、空白对照组 (缓冲液)；c、样品测定组 (样品+缓冲液+酶液+底物)；d、样品空白组 (样品+缓冲液)；e、阳性对照组(8 μLAcarbose+缓冲液+酶液+底物)。

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1.2 赤芍各提取部位体外抗氧化活性研究

1.2.1 仪器、试剂与材料

a：仪器与

1.1.1 同

b：试剂

按照文献[13]，将样品配制成一系列质量浓度，取 10 μL 样品溶液加入到 96微孔板中，再加入 175 μL DPPH 甲醇溶液，37 ℃孵育 30 min 后测定 515 nm 处吸光度值，每份样品平行操作 3 次，取平均值。计算出清除率及半数清除率 IC50值。IC50表示抑制 50%DPPH 自由基时所需样品的浓度 (μg/mL)，通过软件 Origin8.0 做出浓度-效应线性回归曲线，计算出样品的 IC50。

表 1-2 显示五没食子酰葡萄糖，原儿茶酸清除 DPPH 自由基的能力均强于阳性对照 BHA、BHT，但弱于阳性对照 PG，赤芍乙酸乙酯部位清除 DPPH 自由基的能力强于阳性对照 BHT。抑制能力大小依次为：PG (IC50=4.02±0.37 μg/mL) 、五没食子酰葡萄糖 (IC50=6.00±0.10 μg/mL) 、原儿茶酸 (IC50=7.35±0.56μg/mL) 、BHA (IC50=11.73±0.48 μg/mL) 、赤芍乙酸乙酯部位 (IC50=15.18±0.31μg/mL) 、BHT (IC50=15.44±0.93 μg/mL) 、赤芍正丁醇部位(IC50=35.40±0.30μg/mL)。

由图 1-4 可看出，各样品清除 DPPH 自由基的能力随着质量浓度的增大呈上升趋势，在一定浓度范围内显示出剂量依赖性，当浓度低于 10 μg/mL 时赤芍乙酸乙酯部位、五没食子酰葡萄糖、原儿茶酸、PG、BHA 对 DPPH 自由基的清除能力随浓度的升高趋势增长较快，当浓度大于 10 μg/mL 时，增长趋势变得平缓。赤芍正丁醇部位、BHT 一直呈缓慢增长趋势。

从表 1-2 可看出原儿茶酸 (IC50=0.74±0.04 μg/mL)，五没食子酰葡萄糖(IC50=0.66±0.02 μg/mL) 清 除 ABTS 自 由 基 的 能 力 强 于 阳 性 对 照 BHA(IC50=0.93±0.00 μg/mL)、BHT (IC50=4.98±0.28 μg/mL)，但弱于阳性对照 PG(IC50=0.37±0.029 μg/mL)，苯甲酰芍药苷 (IC50=30.83±3.08 μg/mL)对 ABTS 自由基也有一定的抑制作用。对 ABTS 自由基抑制能力大小顺序依次为：PG、五没食子酰葡萄糖、原儿茶酸、BHT、BHA。

从图 1-5 可看出，赤芍提取物和化合物清 ABTS 自由基的能力随着质量浓度的增大逐渐升高，显示出浓度依赖性，五没食子酰葡萄糖和原儿茶酸在浓度为1.49 μg/mL 时对 ABTS 自由基的清除率已接近 100%，当浓度在 0~1 μg/mL 时，阳性对照 PG 对 ABTS 清除能力增长最快，五没食子酰葡萄糖和原儿茶酸增长趋势接近，当浓度大于 1 μg/mL 时，PG 的增长趋势开始平缓。当浓度大于 1.5 μg/mL时，五没食子酰葡萄糖和原儿茶酸的增长趋势开始趋向平缓。当浓度大于2 μg/mL时，BHA 增长趋势变缓。BHT 一直呈缓慢升高。

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第二章 赤芍提取物体内降血糖作用研究

2.1 样品、仪器与试剂

a: 样品

赤芍石油醚部位、赤芍乙酸乙酯部位、赤芍正丁醇部位。提取方法同 1.1.1。

b: 仪器与试剂

仪器：UV－2000 型紫外可见分光光度计 (上海尤尼科仪器有限公司)；LRH－150 型恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)；全波长酶标仪 (美国 ThermoElectron 公司)；电子天平 (美国 Mettler－Toledo 公司)，水浴锅 (型号 HH-S，常州翔天实验仪器厂)，离心机 (型号 TGL-16，江苏金坛市中大仪器厂)。

c：试剂

四氧嘧啶(美国 AlfaAesarAJohnsonMatthey 公司)；葡萄糖测定试剂盒 (批号20140201147，上海荣盛生物药业有限公司)；肝/肌糖元试剂盒 (批号、丙二醛测试盒 (MDA，批号 、超氧化物歧化酶试剂盒 (SOD，批 ( 南京建成生物工程研究所 )；总胆固醇试剂盒 (TCH ，批号2014050001) 、甘油三酯测定试剂盒 ( TG，2014030025) (上海北海生物科技工程有限公司)；其余试剂均为分析纯。UV－2000 型紫外可见分光光度计 (上海尤尼科仪器有限公司)；LRH－150 型恒温培养箱 (上海一恒科技有限公司)；全波长酶标仪 (美国 Thermo Electron 公司)；电子天平 (美国 Mettler－Toledo 公司)。

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2.2 实验方法

a： 模型的制备：根据参考文献[4]，预选健康昆明雄性小鼠 170 只，4～6周龄 ( 18～22 g)，将小鼠随机分组，每组 10 只小鼠均禁食不禁水 12 h，其中 10只做空白对照，其余 160 只尾静脉注射 80 mg/kg 四氧嘧啶 ( ALX) ，注射过四氧嘧啶后立即给与小鼠饲料，在小鼠低血糖时可给予葡萄糖水做饮用水。连续喂养 72 h，然后从小鼠眼眶取血 3～4 滴，为防止血糖分解或者放置凝固，取血后立即离心得血清，测血糖水平，选用血糖水平在 11.1~28.0 mmol/L 的小鼠 110 只，随机分成糖尿病模型，赤芍不同提取部位高、中、低剂量给药组、阿卡波糖阳性对照组以及模型组，每组 10 只。

b： 实验过程： 实验给药组分别以不同剂量赤芍提取物浸膏灌胃治疗，阿卡波糖阳性对照组给予 75 mg/kg 的阿卡波糖，空白对照组小鼠给予同等剂量的CMC，1 次/d，连续给药 7 d 于末次给药后 2h 眼眶取血测定餐后血糖水平，并于当晚禁食不禁水 12 h，于次日早上摘眼球取血，处死动物，分离血清，取肝脏称重用，配制肝脏匀浆液，并测定肝糖元含量；用分离得到的血清测定小鼠空腹血糖、MDA、SOD、TG、TCH 的含量。

c：指标测定方法：空腹和餐后血糖的测定按上海荣盛生物药业有限公司生产的试剂盒说明书操作；肝糖元、MDA、SOD 均按南京建成生物工程研究所生产的试剂盒上说明书操作； TG 和 TCH 的测定均按照上海北海生物科技工程有限公司生产的试剂盒说明书操作。

d： 数据处理：统计学处理采用 SPSS19.0 软件；处理的数据均以 x±s 表示；各组别之间的差异采用 One－wayANOVA 分析； t 检验比较两组均数之间的差别。

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第二章 赤芍提取物体内降血糖作用研究.......................14

2.1 样品、仪器与试剂..................................... 14

2.2 实验方法............................................. 15

2.3 结果................................................. 16

2.3.1 赤芍不同提取物对小鼠空腹血糖和餐后血糖的影响....... 16

第三章 赤芍药理作用研究进展...............................28

3.1 抗菌消炎作用.......................................... 28

3.2 抗内毒素作用......................................... 29

3.2 对血液系统的作用..................................... 30

3.2.1 补血作用........................................... 30

第三章 赤芍药理作用研究进展

3.1 抗菌消炎作用

张芳等[3]研究赤芍不同萃取部位抗菌活性，发现赤芍正丁醇相萃取物对肺炎克雷伯杆菌、鲍氏不动杆菌和粘质沙雷氏菌最低抑菌浓度均为 400 mg/L，活性最好；将正丁醇萃取相分别与 4 种抗生素协同作用实验中发现，正丁醇萃取物对红霉素的抑菌能力无影响，能使四环素的 MIC 值降低 50%，但能明显增强诺氟沙星和氯霉素的抗菌效果，其中使诺氟沙星对鲍氏不动杆菌的 MIC 值降低 97%。因此可知，赤芍萃取物有明显的抗菌作用，且可与部分抗生素协同作用。

雷玲等[9]研究赤芍及其活性部位对内毒素(LPS)的拮抗作用，制备含不同活性的赤芍提取物，应用在体外对内毒素中和的定性定量试验，对内毒素所致家兔发热的影响以及对内毒素致小鼠死亡的保护作用等实验，观察抗内毒素作用。发现赤芍水煎液及从赤芍水煎液中分离的赤芍总苷在体外、体内均表现明显的抗内毒素作用，能明显降低内毒素静脉攻击所致小鼠死亡率。因此，赤芍有抗内毒素作用，且赤芍总苷为赤芍主要的抗内毒素有效部位。

杨军等[45]发现赤芍总苷具有抗衰老及促进学习记忆能力的作用， 许惠玉等[46]发现赤芍总苷具有调节免疫系统的失衡功能，赤芍总苷能促进小鼠免疫功能，具有逆转化疗后小鼠免疫抑制状态的作用，调节免疫系统的失衡。赤芍作为我国传统的活血化瘀药，临床应用较为广泛，在心血管疾病高发的今天，有巨大的研究潜力。而近几年赤芍总苷对肿瘤细胞的抑制作用的发现也显示其可能具有其他的潜力有待研究，同时也提示研究人员在中药材中发现抗肿瘤新药潜力巨大，意义深远。

本文首次测定了赤芍提取物对糖尿病小鼠血清 SOD、MDA、TCH、TG 等指标的影响。结果表明，与模型组相比，赤芍不同提取部位对糖尿病小鼠的空腹血糖均有降低作用，均能明显升高肝糖原的含量，且差异均有显著性。一定程度上对餐后血糖有降低作用。各提取部位均能降低小鼠体内 MDA 含量，乙酸乙酯部位、正丁醇部位，均能明显提高小鼠体内 SOD 含量，且差异有显著性。各提取部位均能明显降低小鼠 TG、TCH 水平，且差异有显著性。综合各项测定指标，表明赤芍能够有效降低糖尿病的血糖值，改善脂质过氧化水平，减少或缓解并发症的产生。因此赤芍对糖尿病有较好的疗效，赤芍良好的抗氧化活性显示其降血糖的主要作用机制可能与清除体内自由基的途径有关。赤芍的活血作用在临床上应用广泛，而其降血糖作用，目前应用较少，本研究对赤芍不同提取部位的降血糖作用和抗氧化作出补充。

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论文创新点

1，本文首次采用 ABTS 法、FRAP 法、抗过氧根离子损伤法测定赤芍不同部位提取物的抗氧化活性。

2，本文首次采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型测定了赤芍不同部位提取物对糖尿病小鼠影响。

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参考文献（略）